“透明”的道路——光透明技术与神经科学

撰文丨之悯（华中科技大学生物医学工程博士）

责编丨高阳

排版丨小箱子

著名的恐怖电影《透明人》给不少人留下了深刻的印象，抛开科幻电影，现实中真的存在使生命体变透明的技术吗？答案是肯定的，近年来发展出了能够使离体组织和大小鼠全身透明的光透明技术，使科幻电影中的“透明”生物成为可能。光透明技术，顾名思义，就是通过多种物理化学手段，减小组织对光的散射，使不透明的生物组织变透明。该技术与荧光标记技术、光学成像技术结合，能够获取完整组织的三维整体结构信息，这样的技术是不是非常奇妙？

封面图片孕11.5天小鼠胚胎的周围神经（2013年尼康微观世界显微摄影大赛获奖作品）

光透明技术是如何实现的？

光透明是如何让生物组织透明的呢？要理解这个问题，就需要先知道组织为什么不透明。生物组织成分复杂，像蛋白质、脂质和血红素这些物质，对光穿透组织非常不友好。光透明技术就是使用物理和化学手段将这些物质除去，同时将组织浸泡在折射率匹配的高渗透高折射率的试剂中（图1），通过这样的处理，组织就会变得透明，给光穿透组织大开方便之门。

图1 光透明技术基本原理

光透明技术简介

现代光透明技术的研究，其实在很长一段时间内处于停滞的状态。人们对生命奥秘的探索随着认知的加深越发的全面。从局部到整体，人们意识到三维成像的重要性，而这一迫切的需求使得光透明技术在近十年的时间内呈现出井喷式发展。光透明技术的蓬勃发展如同春秋战国时期的“百家争鸣”，各种不同的透明试剂和方法提供给科研工作者多种选择。光透明技术方法及所用试剂种类繁多，我们可以将其归类为脂溶性光透明技术、水溶性试剂透明技术和水凝胶包埋透明技术。

脂溶性光透明技术从原理上来讲，将脂溶性的试剂引入组织中，达到透明效果。一般而言，生物组织都含有大量的水分，需要先用“油水互融”试剂作为媒介，除去水分，然后再引入脂溶性的试剂。乙醇和有机试剂BABB就是最早选出来的“黄金搭档”。水溶性光透明技术的发展充满了偶然性和戏剧性。Miyawaki团队将新生的小鼠胚胎放入尿素中，意外发现小鼠胚胎完全透明了（图2），据此该课题组建立了以尿素为基础的Scale透明方法。后续根据尿素透明的原理，建立了一系列相关的水溶性试剂透明方法。水凝胶包埋透明技术也是采用去除脂质达到组织透明，与尿素被动去除脂质不同，该方法采用了新颖的生物材料——水凝胶（丙烯酰胺）作为组织固定和包埋的主要试剂，通过电泳主动除去脂质。水凝胶单体酰胺结构好像一只只小手，能够紧紧抓住组织中蛋白质的小尾巴（氨基末端），再通过单体直接的交联形成一张紧密的“蛛网结构”，把生物组织内部的蛋白质牢牢的粘在“蛛网”上。随后通过电泳技术和强离子去污剂（SDS），像洗衣服一样，将没有黏在“蛛网”上的脂质冲洗掉，以此达到透明效果。

图2 Scale技术获取的小鼠胚胎透明图像[1]

光透明技术的应用

光透明的方法种类很多，目前约有二十余种，并且新的方法层出不穷，光透明技术仍在不断发展和完善。基于光透明方法的不断涌现和发展，相关的应用研究也得以快速发展。

图3 uDISCO技术获取的病毒注射小鼠神经环路三维图像[2]

光透明技术广泛应用于神经环路的示踪。神经环路示踪技术简单来说就是使用特殊的病毒特异性感染神经元，病毒经过研究者的改造，能够使被感染的神经元带有绿色或者红色的荧光。通过这种颜色的显示，我们能够看到不同脑区神经元及其纤维的投射情况，以及它们又是如何连接在一起的。以uDISCO（ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs）为例，联合病毒示踪技术可以帮助我们理解神秘莫测的神经环路（图3）。图中绿色和紫红色是被病毒（AAV-GFP/RFP）标记的皮层神经元。我们能通过重建的三维图，清晰看到皮层神经元发出的神经纤维延伸到脊髓末端。像这样长距离的投射在神经系统里比较常见，如果采用传统切片染色的方法，我们很难清晰直观地看到如此长的神经投射。而光透明技术的出现，就像将图片变成动画片一样，可以呈现出一个生动活泼的影像。除应用于神经环路研究，光透明方法也常用于观察胚胎的发育过程。如图4所示，利用光透明技术可观察孕14.5天的胎鼠全身神经丝，这样色彩鲜亮美丽的三维图，是不是很好地勾勒了胚胎发育的神奇和梦幻呢？

图4 MACS技术获取的免疫组织化学标记的胎鼠神经丝三维图像[3]

此外，光透明技术在心脑血管研究中也起到了重要的推动作用。脑外伤或脑血管病造成的神经系统损伤对身体健康带来极大影响，甚至会危及生命，是人们一直以来谈虎色变的话题。以往由于方法的限制，多数研究都有“头痛医头，脚痛医脚”的局限，很少能够观察到模型动物的病理改变的全貌，对于其伴发外周症状的认识仍存在局限。vDISCO（nanobody(VHH)-boosted 3D imaging of solvent-cleared organs）技术的出现打破了这样的僵局，该技术被美国国立精神卫生研究所所长Thomas Insel评价为“这可能是几十年来神经解剖学最重要的进展之一”。vDISCO技术在对小鼠进行透明化处理后，利用纳米抗体选择性对特定的细胞类型进行标记。在不破坏机体结构的情况下，不仅可以将小鼠体内不同类型细胞的互作关系清晰准确地呈现出来，而且可以真正“透视”小鼠细胞、组织及器官的状态以及之间的联系。针对于脑损伤后引起或伴发肢体症状，研究者使用vDISCO透明技术，从脑损伤造模后的小鼠获取了全身三维图像，有助于直接观察研究脑损伤后引起肢体动作不灵活的神经机制。从图5中我们能够看到，与未经受脑损伤的小鼠相比，脑损伤后小鼠上肢神经丛数量明显降低。这种全身透明技术，展示了病理状态下，器官之间神秘的互相影响，为未来治疗创伤性脑损伤提供新的思路。

图5 vDISCO技术获取的外伤性脑损伤（TBI）小鼠周围神经系统变形三维成像图[4]

综上所述，处于不断发展和完善的光透明技术，在神经环路示踪、胚胎发育以及神经疾病研究中已经有了较广泛的应用。传统透明化技术只能对软组织进行处理，随着技术的不断发展，目前已能够同时实现软组织和骨骼等硬组织的透明化处理，期待这一技术能够得到进一步发展，并凭借其独有的优势未来在肿瘤转移、干细胞移植疗效评估等领域得到更多应用，帮助我们更深入地探索机体生理及疾病的奥秘。

封面来源
Zhong Hua (Johns Hopkins School of Medicine)
https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2013-photomicrography-competition

参考文献
1.Chen, L., et al., UbasM: An effective balanced optical clearing method for intact biomedical imaging. Scientific Reports, 2017. 7: p. 12218.
2.Pan, C., et al., Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods, 2016. 13: p. 859-867
3.Zhu, J., et al., MACS: Rapid Aqueous Clearing System for 3D Mapping of Intact Organs. Advanced Science, 2020. 7: p. 1903185.
4.Cai, R., et al., Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience, 2019. 22: p. 317-327.