【转录组入门】4：参考基因组和注释文件

作业要求：

在UCSC下载hg19参考基因组，我博客有详细说明，从gencode数据库下载基因注释文件，并且用IGV去查看你感兴趣的基因的结构，比如TP53,KRAS,EGFR等等。
作业，截图几个基因的IGV可视化结构！还可以下载ENSEMBL，NCBI的gtf，也导入IGV看看，截图基因结构。了解IGV常识。

参考基因组--下载

地址：UCSC https://genome.ucsc.edu/

(1)、进入UCSC---选择Downloads---genomic data---human---GRCh37/hg19---Full data set，下拉，找到chromFa.tar.gz,右击chromFa.tar.gz，选择“复制链接地址”

# 点击 Full data set后，有各类文件的说明文档

(2)、终端命令行操作

 1 # 切换到要存放参考基因组的目录
 2 $ cd data/GSE81916/reference/genome/hg19
 3 
 4 # 用axel或wget下载参考基因组
 5 $ nohup wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/chromFa.tar.gz    # wget后面跟的是参考基因组的下载地址
 6 
 7 # 解压下载后的文件
 8 $ tar -zxvf chromFa.tar.gz
 9 
10 # 解压后可以发现，参考序列是按照染色体号分开列出的，我们还需要把所有的序列写入到一个文件中。
11 $ cat *.fa > hg19.fa
12 
13 #最后删除其他无用的文件
14 $ rm chr*.fa

注释文件--下载

（1）、进入Gencode数据库---Data---Human---GRCh37-mapped Release---选择2016年10月份发布的最新注释版本“gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz”

鼠标右击，“复制链接地址”

（2）、命令行批量下载

1 # 用axel批量下载
2 $ axel ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_human/release_26/GRCh37_mapping/gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz
3 # 下载后解压
4 $ gzip -d gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz
5 # 与下载的hg19参考基因组放在一起
6 $ mv genconde.v26lift37.annotation.gtf  ./Reference/Human/hg19

补充：GTF和GFF之间的区别

数据结构：都是由9列构成，分别是reference sequence name; annotation source; feature type; start coordinate; end coordinate; score; strand; frame; attributes.前8列都是相同的，第9列不同。

GFF第9列：都是以键值对的形式，键值之间用“=”连接，不同属性之间用“；”分隔，都是以ID这个属性开始。下图中有两个ID，说明是不同的序列。

GTF第9列：同样以键值对的形式，键值之间是以空格区分，值用双引号括起来；不同属性之间用“；”分隔；开头必须是geneid, transciptid两个属性。

基因组浏览器：IGV

Integrative Genomics Viewer(IGV)是一种探索大型综合基因组数据的高性能交互式可视化工具。它支持各种各样的数据类型，包括基于芯片测序、二代测序数据和基因组注释数据等。

IGV下载

 1 # 进入IGV官网，并下载相应的软件包，有Windows，Mac，和LINUX，这里我下载Linux二进制包
 2 $ cd ~/src
 3 $ wget http://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/IGV_2.3.97.zip
 4 $ unzip IGV_2.3.97.zip && mv IGV_2.3.97 ~/biosoft
 5 
 6 # 添加环境变量
 7 $ vim ~/.bashrc
 8    PATH=$PATH:~/biosoft/IGV_2.3.97
 9 $ source ~/.bashrc
10 
11 # 运行IGV，Linux直接运行igv.sh可以开启IGV窗口，但是会比较慢，要耐心等待。
12 $ igv.sh

IGV使用

0、初始化窗口

1、载入基因组，选择Genome标签，load我们之前已经下载好的hg19.fa基因组。

2、载入基因组注释，但是在载入之前需要将gff3进行排序，选择Tools-Run igvtools，进入以下igvtools窗口：

3、获得sorted文件：command选择sort，再选择输入的注释文件，点击Run，就可以生成sorted.gff3文件。

4、通过file->load from file...选择sorted文件，打开。选择区域的大小，来看某些基因的信息，蓝色的粗线条就是代表基因。说到底，IGV就是一个将基因组及其注释信息可视化的工具。（下图是载入基因组和注释信息后的窗口）

理论知识

RNA-seq数据分析的通用套路是：

1、检测测序数据的质量，如果需要，对数据进行预处理，去掉接头，去掉质量差的数据等等

2、将所有数据回帖到genome，根据结果，进行新基因或转录本的鉴定，然后对转录数据进行定量，并进行差异表达分析。也可跳过对新基因和新转录本的分析，只对已知的基因和转录本进行定量。

3、如果没有参考genome数据，可以供transcritome数据代替。

4、如果参考转录组数据也没有，可以直接对RNA-seq数据进行从头组装，注释，作为参考转录组。

图片源于《RNA-seq Data Analysis》

把高通量测序得到的reads回帖到参考基因组上，既是进行后续基因表达定量和差异表达分析的基础，同时也是可变剪接分析、SNP、InDel分析以及测试数据质量控制的一部分

回帖常用软件：HISAT2, STAR

参考基因组

参考基因组的实质：就是某一物种的基因组序列，因此是fasta格式。

三大网站：

1.NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc）

2.UCSC (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/downloads.html)

3.Ensemble （http://asia.ensembl.org/index.html?redirect=no）

三大网站的ftp地址：

ensembl : ftp://ftp.ensembl.org/pub

NCBI : ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/

UCSC：ftp://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath

推荐：去Ensemble下载参考序列，（UCSC很久没更新）

目前最常用的人的参考基因组版本如下（Jimmy总结）：

NCBI	UCSC	Ensemble
GRCh36	hg18	ENSEMBL release_52
GRCh37	hg19	ENSEMBL release_59/61/64/68/69/75
GRCh38	hg38	ENSEMBL release_76/77/78/80/81/8

注释文件

就是基因组的说明书。告诉我们哪些序列是编码蛋白的基因，哪些是非编码基因，外显子、内含子、UTR等的位置等等。注释文件在以上三个提供参考基因组的网站中都有提供，比如Ensemble。但是现在最权威的人类和小鼠基因组的注释还属Gencode数据库。

IGV软件界面简介

主窗口布局：

1.工具栏tool bar

2.红色框显示当前显示的染色体的位置，当缩小显示范围到整个染色体范围时，红色框消失。

3.显示当前查看的染色体序列的长度

4.该窗口显示测序样品的测序情况。每一条track代表一个样品或者一次实验，显示的情况包括甲基化、表达水平、拷贝数，碱基突变等信息。

5.参考基因组信息

6.track名（即样品或者实验名）

7.Attribute names属性名，即序列信息，如indel、甲基化等。

更多的使用方法可查看IGV User Guide

参考资料

转录组入门(1)-作业-转录组-生信技能树 http://www.biotrainee.com/thread-1796-1-1.html

HOPTOP转录组入门（一）布置运行环境-转录组-生信技能树 http://www.biotrainee.com/thread-1800-1-1.html

RNA-seq基础入门传送门-转录组-生信技能树 http://www.biotrainee.com/thread-1750-1-1.html

浙大植物学小白的转录组笔记 http://www.360doc.com/content/17/0911/22/46164085_686360709.shtml

来源：oschina

链接：https://my.oschina.net/u/4325071/blog/3920920

标签

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