顶刊综述 | mNGS的临床应用与挑战

如果说宏基因组学是大家关注的焦点，那么mNGS应该是宏基因组学焦点中的NO.1，尤其是在新冠疫情的大环境下。

mNGS在临床中的实际应用如何？在临床实验室中又面临着怎样的挑战？...这些问题的答案都在今天分享的这篇综述中。2020年6月，来自美国的研究人员在《Nature Reviews Genetics》杂志（IF=33.133）发表了关于mNGS的综述，回顾了mNGS在临床和公共卫生环境中的各种应用，讨论了在临床实验室中采用mNGS所面临的挑战，并提出了克服这些挑战的步骤。同时展望了mNGS在临床领域的未来发展方向。

临床微生物学：从传统技术到mNGS

临床微生物学领域包括诊断微生物学、从临床样本中识别病原体以指导感染患者的管理和治疗策略、公共卫生微生物学以及社区监测和监测传染病暴发等。微生物的传统诊断技术包括：培养物中微生物的生长和分离，病原体特异性抗体（血清学）或抗原的检测以及微生物核酸（DNA或RNA）的分子鉴定，通常是通过PCR进行的。尽管大多数分子分析使用特定的引物或探针仅靶向有限的病原体，但宏基因组学方法可表征样品中存在的所有DNA或RNA，从而能够分析患者样品中的整个微生物组以及人类宿主基因组或转录组。宏基因组学方法已经应用了数十年，以表征各种生态位，从海洋环境到有毒土壤到节肢动物疾病载体再到人类微生物组。

mNGS是对患者样品中微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）的全面分析，正在迅速地从研究转移到临床实验室。mNGS正在改变医生诊断和治疗传染病的方式，其应用范围广泛，包括抗菌素耐药性，微生物组，人类宿主基因表达（转录组学）和肿瘤学。mNGS已成为精确诊断传染病的关键驱动力，推动了精确医学工作在该领域的个性化患者护理。

mNGS的临床应用

到目前为止，mNGS的临床应用已经包括对各种综合征和样本类型的传染病诊断，疾病和健康状态下的微生物组分析，通过转录组学鉴定人类宿主对感染的反应以及肿瘤相关病毒及其基因组整合位点的鉴定等。

mNGS的临床应用

使用下一代测序技术的临床微生物学方法

传染病诊断：目前使用的几乎所有常规微生物检测一次只检测一个或一个有限的病原体，或者要求从临床样本中成功培养出微生物。虽然mNGS在速度上无法与传统的检测方法相比，但是mNGS能够从培养物或直接从临床样本中识别出多种病原体——病毒、细菌、真菌和/或寄生虫，因此，mNGS在诊断中的临床应用可能是在最难诊断的病例中，或者对于潜在病原体谱更广的免疫功能低下的病人。临床样本的非靶向mNGS可能是最有前途的感染综合诊断方法。原则上，几乎所有的病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，都可以在一次化验中鉴定出来。

临床微生物组分析：许多研究人员现在用mNGS代替16SrRNA基因的靶向测序来深入鉴定微生物组。微生物组分析的一个未来临床应用可能是在Clostridium difficile相关疾病的管理和治疗中。微生物组学的另一个潜在应用是分析细菌多样性，这可以为患者的疾病是传染性还是非传染性提供线索。例如，一项用于鉴别肺炎患者呼吸道病原体的mNGS研究发现，经培养证实感染的个体，其呼吸道微生物群落的多样性显著降低。

人类宿主感染反应分析：mNGS侧重于微生物的reads数，然而，在研究人类宿主对感染的反应时，基因表达分析有一个补充作用。尽管RNAseq分析通常是在全血或外周血单个核细胞（PBMC）样本上进行的，但任何体液或组织类型都可能适用于这些分析。利用RNA-seq表达谱对基因进行分类已被用于描述几种感染，包括葡萄球菌菌血症、莱姆病、念珠菌病、结核病（区分潜在和活动疾病风险）和流感。基于机器学习的RNA-seq数据分析已被用于癌症分类，而这些方法的使用可能对传染性疾病很有希望。

肿瘤学应用：在肿瘤学中，识别突变基因的全基因组或定向NGS方法可用于同时发现与癌症相关的病毒（即疱疹病毒、乳头状瘤病毒和多瘤病毒）和/或收集病毒与宿主相互作用的数据。例如，mNGS在发现Merkel细胞多瘤病毒中发挥了关键作用。将来，可能会利用液体活检样品（例如血浆）中cf-DNA的mNGS来同时鉴定早期癌症和诊断免疫受损患者的感染。

mNGS的临床实施与挑战

尽管FDA已经为NGS传染病检测的临床验证提供了通用指南，但是对于mNGS试验的临床实施没有明确的建议，也没有提到具体的要求。然而，可以采取一种最佳实践方法，包括故障模式分析和使用具有代表性的有机体评估性能特征，并对意外结果进行持续分析监测和独立确认。

在临床环境中常规部署宏基因组测序的挑战

灵敏度和富集：mNGS的一个关键限制是在高背景噪音下灵敏度降低，背景噪音主要来自人类宿主(例如组织活检)或微生物组(例如粪便)，可能与临床相关，因为感染中的病原体负荷，如腹泻患者粪便中的福氏志贺氏菌可能非常低。目前还没有比较有效的DNA文库并行方法，人类宿主的背景噪音可以通过增加测序深度来克服，另一种提高灵敏度的方法是利用杂交方法进行富集。

实验室工作流程注意事项：

mNGS分析的复杂性要求训练有素的人员和在样品处理方面的极度谨慎，以避免错误和交叉污染。
为进行准确的mNGS分析，通常需要维持一个在mNGS数据中通常检测到的、由正常菌群或实验室污染产生的背景微生物数据库。
临床实验室操作的特点是具有固定的工作流程和预定的人员配备水平（需要经过分子生物学程序培训的临床人员）。考虑到重复性任务和分析流程中对操作者精力和注意力的要求，建议通过轮班执行，有助于避免实验错误。

参考标准：需要具有良好特征的参考标准和控制，以确保mNGS分析的质量和稳定性。

生物信息学挑战：目前还没有用于分析mNGS数据的用户友好型生物信息学软件。因此，用于临床mNGS数据分析的定制生物信息学流程仍然需要训练有素的编程人员来开发、验证和维护。随着测序数据存储的需求越来越大，临床实验室需要考虑数据存储的资源配置，同时由于数据库和分析软件的不断更新，也需要随时校正相关流程以免由于数据更新引入错误。

成本和监测考虑：

mNGS大多数建库方法都需要人工执行，因此需要大量人员配置，而运行和维护生物信息分析流程的成本也相当可观，mNGS样品处理需要在硬件方面进行技术改进，以提高吞吐量并降低成本。
临床实验室是高度规范的，质量控制至关重要，重要的质量控制步骤包括初始样本质量检查、库参数(浓度和大小分布)、序列数据生成(聚类密度和Q-score)、内部控制的恢复和外部控制的执行。在试验开发和实施过程中产生的验证数据应被记录并提供给实验室检查员(用于实验室开发的试验)或提交给监管机构。持续的监测对于mNGS也十分重要，可使用/运行样品内部对照，用于污染的滑动测试和定期能力验证来完成监测。

研究团队预测在未来5年内，评估mNGS临床效用和成本效益的前瞻性临床试验数据将可用；mNGS的总体成本和周转时间将继续下降；mNGS的其他方面（如纳入人类宿主反应和微生物组学数据）将证明临床上有用；机器人样本处理和微流控设备将被开发用于按钮操作；计算分析平台将更广泛地用于本地和云端，从而消除对专门的生物信息学专业知识的需求；至少一些基于mNGS的传染病诊断分析将获得监管部门的批准，并获得临床补偿。我们将见证mNGS的广泛民主化，因为基因组分析不仅对医生和研究人员开放，而且还通过众包计划广泛地向患者和公众开放。

在一个病原体不断出现的世界里，我们设想基于mNGS的检测将在监测和跟踪新的疾病暴发方面发挥关键作用。随着监测网络和纳米孔测序等快速诊断平台在全球部署，将有可能在更早的阶段发现和控制感染性疫情。