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RNA-seq测序方法
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在测mRNA过程中,首先要去除rRNA。以人为例,在抽提的总RNA中,95%的RNA是rRNA,2%的RNA是mRNA,剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。
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rRNA整个人类当中是非常保守的,在各个组织器官中也是非常稳定的,因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。
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Illumina公司的Truseq RNA建库方法是应用最广泛的一种,真核普通转录组为例:
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这个建库方法对mRNA的完整性有较高要求,因此如果mRNA发生降解,那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA断片,会在富集阶段被洗脱,导致最后数据有一定的偏差(在RNA测序质控时就能发现mRNA的3’端以及5’端是否有偏移)。
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一般在会测序前对总RNA进行一次质检,根据电泳质检结果中的18S和28S(rRNA)两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量,峰越高越尖(RIN > 8.0)表示RNA的完整度越好。
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除了mRNA普通文库构建外,还有真核链特异性文库、lncRNA文库、SmallRNA文库等
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针对一些FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本以及原核生物的总RNA 中去除rRNA,不适合用上述mRNA建库方法。需要结合RiboZero、RiboMinus等来去除,其实是针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理 来去除的。
以上主要参考陈巍学基因视频: RNASeq方法及应用
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