基因探针

Illumina的SNP芯片原理 Illumina的SNP生物芯片的优势在于： 第1，它的检测通量很大，一次可以检测几十万到几百万个SNP位点 第2，它的检测准确性很高，它的准确性可以达到99.9%以上 第3，它的检测的费用相对低廉，大约一个90万位点的芯片（每个样本的）检测费用在一、两千人民币 Illumina的生物芯片系统，主要是由：芯片、扫描仪、和分析软件组成。 Illumina的生物芯片，由2部分组成： 第1是玻璃基片，第2是微珠 。 这个玻璃基片，它的大小和一张普通的载玻片差不多大小，它起到的作用，就是给微珠做容器。 在这个玻璃基片上，通过光蚀刻的方法，蚀刻出许多个排列整齐的小孔。每个小孔的尺寸都在微米级，这些小孔是未来容纳微珠的地方。小孔的大小与微珠正好相匹配，一个小孔正好容纳一个微珠。 微珠是芯片的核心部分，微珠的体积很小，只有微米级。 每个微珠的表面，都各偶联了一种序列的DNA片段。每个微珠上，有几十万个片段，而一个珠子上的片段，都是同一种序列。 这些DNA片段 的长度是73个碱基 ，而这73个碱基又分成2个功能区域。 靠近珠子的这一端的23个碱基的序列，被称为 Address序列 ， 它也是DNA片段的5'端。它是标识微珠的标签序列 。标签序列，通过碱基的排列组合，得到许多可能，每种序列，就是相应微珠的身份证号码（ID号）。

表达谱芯片上的探针往往能够覆盖到所有人类基因，也就是说，能够同时检测所有人类基因的表达。但先前的实验表明，一个细胞中不可能所有基因都同时表达，能够同时表达的基因反而是少数。同时表达的基因约占总基因的 40% 左右。 由于探针与目标之间一定存在着非特异性结合，所以所有的探针均会产生信号。如果不加以过滤，认为这些探针对应的基因都表达，即不符合事实，也会对后续的分析产生影响。因此，过滤掉表达量低的探针是十分必要的。 注意，limma包的说明里面提供了两点建议。一，如果要进行探针过滤（filter），最好在 进行标准化之后 再过滤。二，如果要在后续分析中使用limma包，请不要进行 基于方差(variance)的过滤 ，否则会影响方差分布，从而导致limma包处理产生糟糕的结果（poor results）。 bioconductor提供了两种过滤探针的方法，一种是使用专门进行探针过滤的genefilter包进行过滤，另一种是使用affy包中的mas5calls函数进行探针过滤。下面会详细解释如何进行探针过滤。 根据genefilter包的技术文档介绍，genefilter包设计的出发点是进行 independent filtering 。我们知道，检测差异基因表达是表达谱芯片最重要的功能之一。而检测差异基因表达的方法是进行对每一个基因进行统计检验。 所谓的independent

为了防止非特异性结合造成的干扰，芯片厂商往往会使用 多个探针 检测同一个基因的表达。因此，芯片厂商不会使用基因名作为探针的名称，而是使用自己定义的探针名称。要合并重复探针，我们必须先对探针进行注释，确定每个探针对应检测哪个基因的表达，然后再合并重复探针。而后续分析如GSEA，只能对基因进行分析，因此也要求对探针进行注释。 这个方法是金标准，但也是最不常用的方法。为什么呢？你去芯片厂商的网站上搜索一下就知道了。操作界面非常的user-unfriendly，我找了半天都没找到我想要的注释信息。就更别提下载下来对手头的芯片数据进行注释了。 这个方法比较常见，操作起来很简单，既可以手动下载GPL信息，也可以用GEOquery包下载GPL信息。唯一的问题就是GPL文件一般比较大，下载下来不是很方便，还要求我们有一定的R语言基础才能进行注释。 以下用一个例子来演示如何使用GPL文件注释探针。 首先找到你想要分析的芯片数据的信息。这里使用的是GEO数据库 GSE49382 的芯片数据。 点开GSE49382的页面，可以看到GPL信息。用红框框出。是031058-Agilent ATH NAT array的芯片。我尝试去bioconductor里寻找相关的注释包，没找到。也就是说这个芯片不能用bioconductor进行注释， 只能用GPL进行注释 。 点开GPL看看，可以看到GPL的注释信息。