测序深度

测序： 　 　如何计算测序深度，或产出的数据量？ 　　　　10的9次方=1G 　　　　如果测序的read是pair-end的、且每条read长150bp，则，平均测序深度为=（reads数×150bp×2）/（3*10的10次方）。 　　　　　　即：测序得到的碱基总数/人类基因组的碱基对数=平均测序深度。 　　　　　　比如，我想得到30x的测序数据，那么需要的数据量是90G的数据。（此处，还不甚了解，我觉得应该是900G的数据啊） 　　　　　　（人类基因组有30亿个碱基对（3*10的10次方）） 　　　　 　　 　　 测序错误率 ：一般选择的阀值是10的-3次方，即测序错误率是0.001。（PCR的错误率是10的-6次方） 　　 coverage与depth的概念 ：coverage指的是测序数据覆盖的人类基因组的碱基数。depth指的是平均每个碱基被测序read覆盖的次数（即被测到的次数）。 　 　index的含义 ：index用来区分不同的样本。单端index共6个碱基，排列组合，共4的6次方个碱基，无法区分66个样本。故，需要采用双端index。 　　　　　　双端index，分为i5和i7端。i5端有8个碱基，i7端有12个碱基。 　　 测序的cycle ：一个cycle读取一个碱基。也称为：base call。若有index序列，则测序仪会多读几个cycle。 　　

检测cnv的范围：1KB～几M，中值100KB 杂合性缺失，位于一对同源染色体上的相同基因座位的两个等位基因中的一个（或其中部分核苷酸片段）发生缺失，与之配对的染色体上仍然存在 1:在有的文献中指出cfDNA长度一般在167bp,ctDNA一般在145bp.在脑脊液中发现（ctDNA）取代在血浆中。本文对13个病人进行了平均深度（0.4X）的测序，测序每个样本数据量标准化到10Mreads。在13人中有5人发现了 somatic copy number alterations (SCNAs)基因组按照30K的大小分成没有overlap的bin区域，根据GC含量矫正比对reads数量，拷贝数变异分析使用R软件包CNAclinic（https://github.com/sdchandra/CNAclinic ），reads counts标准化是使用中值，以及log化 影响因子：10.293 Mouliere F, Mair R, Chandrananda D, et al. Detection of cellfree DNA fragmentation and copy number alterations in cerebrospinal fluid from glioma patients[J]. EMBO molecular medicine, 2018: e9323. 2

考虑到cnblog不适合基因组领域这种类型的文章， 最终，我自己开通了公众号：碱基矿工，欢迎感兴趣的同学关注！ 也可以关注我的知乎：https://www.zhihu.com/people/yellowtree/activities 2018年1月修改：这篇文章写于2013年，首发在cnblog上，目前已经比较旧了。我重新在WGS系列中对其进行重写， 建议移步到这里 　　摘要： 从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法） 1 ，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 　　生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 　　第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆

基因疗法研究报告 作者：郭敏 人工智能对医疗和健康产业的冲击和革命 文章分四部分： 1、基因治疗的现状与前景（存在的困难、基因治疗的技术） 2、基因治疗与大数据的关系 3、基因治疗与人工智能的关系 4、个人看法 第一部分 ：基因治疗的现状与前景 人类细胞基因治疗的临床实验已经开始。进行基因治疗必须具备下列条件：1）选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；2）纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；3）该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4）具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。近三年来，以对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。基因治疗将是21世纪医药领域的最大突破。随着人类基因计划的完成，人体的重要生理活动与疾病相关的基因不断被发现，人们已经逐步认识到大多数疾病是由于基因结构和功能的改变而引起的，基因治疗将带来临床医学的巨大革命。基因治疗的手段将越来越多的应用于诸如病毒性传染（如各型肝炎、艾滋病等）、恶性肿瘤、心血管疾病、老年病等目前尚无理想治疗方案的疾病的治疗。除此之外，基因治疗将为多种疾病预防的有效措施之一。作为生物技术发展的前沿，毋庸置疑，基因治疗将为多种疑难杂症的治疗开辟更广阔的前景，进而为人类的健康带来不可估量的利益。目前，基因治疗已经从盲目阶段进入了理性化阶段。尽管基因治疗仍存在安全性

扩增子常见问题 01 实验室检测的DNA浓度很高，送到公司检测之后浓度却比较低呢？ 1、老师在实验室多采用Nanodrop对DNA浓度进行检测，而在公司我们会结合Qubit、Nanodrop、琼脂糖电泳三种方法检测DNA样品的质量； 2、由于不同检测方法的原理不同，所以检测出的结果也会存在一定的差异。其中，Nanodrop检测法是基于紫外分光光度原理进行检测，由于DNA样品中可能含有部分杂质，因此会造成结果虚高的现象；Qubit检测法则是基于荧光标记的原理进行检测，结果会更准确； 3、当两种检测方法的结果出现差异时，我们以Qubit检测结果为准。 个人经验：我用CTAB法提取的小麦总DNA， Nanodrop检测浓度大于1000 ng/ul，结果公司返回的检测报告只有100 ng/ul，差别可达10倍。可能是植物多糖含量高，DNA纯度比较难保证。 02 在计算微生物群落样品之间的距离时，分别基于加权与非加权两种不同的算法绘制出的结果展示图有什么不同？如何进行选择呢？ 1、在计算微生物群落样品之间的距离时，加权是考虑到样品中OTUs的相对丰度信息，而非加权则没有考虑物种的相对丰度信息； 2、如果老师研究的生物学问题与物种的相对丰度信息密切相关，使用加权算法的结果展示可能更为符合；如果研究的生物问题与丰度关系不密切，或者各组的区分与低丰度的OTUs更为密切

灵敏度 高 == 假阴性率低，即漏检率低，即有病人却没有发现出来的概率低。 用于判断：有一部分人患有一种疾病， 某种检验方法 可以在人群中检出多少个病人来。 特异性 高 == 假阳性率低，即错把健康判定为病人的概率低。 用于：被某种试验判定为患病的人中，又有多少是 真的患了这种病 的。 好的检测方法： 有高的灵敏度（低的假阴性率）、同时又有高的特异性（低的假阳性率）。 ROC 曲线： 横轴：100 — 特异性。。即100减去特异性，特异性高，100减去特异性就低，故越小越好。 纵轴：灵敏度值。 ROC分析图的解读原则： 曲线越是靠近整个图的 左上方，方法越优 ； 越是接近 对角线，方法越差 ； 评价的 客观标准 是 曲线下方的面积占整个图的面积比例 。即AUC（曲线下面积，Area Under Curve,AUC)。 面积比例越接近1，方法越好 ；面积比例越接近0.5，方法越差。 ctDNA 循环肿瘤DNA，英文叫：circulating tumor DNA，简称ctDNA。对ctDNA进行测序，是目前很火的Liquid Biopsy（液体活检）中的一种。 意义 首先，我们来说一下ctDNA测序的临床意义。 第一，就是它可以减少病人的开刀痛苦， 只要抽血 ，不必开刀，就可以做检测。 第二，是它可以 增加可检测的病人范围 ，对于不适合做开刀手术的病人。例如，已经发生肿瘤全身转移的病人

人类全基因组测序06 SNP( single nucleotide polymorphism)：有了10倍以上的覆盖深度以后，来确认SNP信息，就相当可靠了。 一个普通黄种人的基因组，与hg19这个参考基因组序列相比，会有350万个左右的SNP。又有大概2万个是落在外显子上的，而非同义的SNP有大概9千个。 所谓非同义的SNP，就是这些SNP是会引起蛋白质的序列变化的。 　　 indel ：(insertion & deletion)是指小于50个bp以内的微小的插入、和缺失突变。一个普通黄种人的基因组和hg19相比，约有50万个Indel。其中落在外显子上的，大概在1千个左右。 　　　　那么Indel如果一旦落在外显子区域，它 一定会 引起蛋白质序列变化的。 　　　　　　如果它引起的是移码突变，那么在移码位点之后，所有氨基酸序列就和原来的序列完全不同。 　　　　　　如果它（基因）还能保持原来的阅读框，也会引起蛋白质中若干个氨基酸的增或者减。 　　 SV ： structure variation 染色体结构变异 　　　　 1、 染色体内部的位移 2、 染色体之间的位移 3、 大片段的缺失 4、 大片段的插入 5、 大片倍的加倍 6、 大片段的倒位 　　 CNV ：copy number variation 拷贝数变异， 是指染色体片段的拷贝数变异：包括拷贝数增加，也包括拷贝数减少

转录组分析的正确姿势 转录组分析是目前应用最广的高通量测序分析技术之一。常见设计是不同样品之间比较，寻找差异基因、标志基因、 协同变化基因 、差异剪接和新转录本，并进行 结果可视化 、 功能注释 和 网络分析 等。 转录组的测序分析也相对成熟，从RNA提取、构建文库、上机测序再到结果解析既可以自己完成，又可以在专业公司进行。 概括来看转录组的分析流程比较简单， 序列比对 - 转录本拼接 (可选) - 表达定量 - 差异基因 - 功能富集 - 定制分析 。整个环节清晰流畅，可以作为最开始接触高通量测序学习最合适的技术之一。 但重点和难点在于理解这些过程都是怎么做的，有什么需要注意的，结果怎么解读，后续分析怎么做。这些只有自己动手操作过，才可能有理解。而理解了一个，再去做其它类型分析，也会轻松很多。 而且现在三代测序火起来了，该怎么去选择呢? 三代测序能帮我们解决什么问题，不能做什么，有什么需要注意的，分析起来有什么不同，二代-三代如何统一分析？也是我们面临的一个新问题。 实验设计这块重要的是对照和至少 3 个生物学重复，并选择合适的测序通量。 ENCODE 要求重复之间的 Spearman correlation 值大于 0.9 (遗传背景不一致的生物重复相关系数要大于 0.8 )。定量基因表达和评估转录图谱相似性只需要中等测序深度；而研究新转录本和可变剪接则需要更深的测序

买个什么样的测序仪? 已有 2610 次阅读 2019-7-16 14:26 | 个人分类: 生物科技 | 系统分类: 观点评述 | DNA , 测序仪 , 分子检测 近些年来，人类全基因组测序或全外显子组测序在临床上的应用越来越多，基因测序的价格越来越低，基因测序仪的也越来越便宜。许多大的医院也在开始考虑购买测序仪，建立自己的基因测序系统，用于各种相关疾病的基因检测和分子诊断。 有自己的测序仪当然是好事。但是，考虑到仪器价格昂贵，不容易操作，数据分析专业性极强等因素，因此，在花费数百万和数千万资金之前，还是要慎重考虑一下。因为，请专业测序公司来做的费用越来越低。 本文对市售的不同DNA测序仪的特性，有什么优点？缺点是什么？在什么情况和条件下，应该购买什么样的测序仪？做一简短回顾。 illumina HiSeq X Ten HiSeq X Ten实际上是十台HiSeq X组成。每个HiSeq X仪器可以运行两个流动槽，每个流动槽有8个泳道。每个泳道将产生380-450百万个150PE读数（paired-end 150bp）。预计将在计算系统上额外支付数百万元来处理数据流。保持流动槽有序运行不太容易，有时可能导致高达30％的“光学信号重叠，optical duplicates”（实际原因是从一个孔溢出到相邻的孔）。你可以达到每3天测定160个基因组。目前

自从第一代测序技术Sanger测序发明以来，使得人们可以不断在单碱基水平研究各物种的基因组序列 。由于Sanger测序价格昂贵，测序通量低等劣势，2005年左右二代测序相继被开发出来，极大地降低了测序的价格和提升了测序的通量。现在测一个人的基因组序列，只需不到1000美元。 测序可以在很多不同的层面开展，包括基因组层面、转录组层面、甲基化层面、免疫共沉淀测序等。今天我们重点讨论一下基因组层面的测序。 基因组层面的测序主要可以分为三大类： 全基因组测序（whole-genome sequencing，简称WGS）、全外显子测序（whole-exome sequencing，简称WES）、靶向测序（targeted sequencing或panel sequencing） （更多精彩请关注微信公众号：AIPuFuBio）。 全基因组测序 ，顾名思义就是对整个基因组的所有碱基进行测序，这样就可以获得整个基因组的序列情况，主要应用有基因组组装、各类基因组变异的鉴定，包括结构变异等。 全基因组测序示意图（ 图片来源：http://www.genomesop.com/） 全外显子测序 ，是对基因组的所有外显子进行测序（通常是编码基因的外显子）。对于人来说，外显子序列大概占到人类基因组序列的2%左右。主要应用于鉴定单核苷酸变异或少量碱基的插入或缺失等。 全外显子测序示意图（ 图片来源：http: